Interferenciniai veiksniai PGR reakcijose

PGR reakcijos metu dažnai susiduriama su kai kuriais trukdančiais veiksniais.
Dėl labai didelio PGR jautrumo užterštumas laikomas vienu iš svarbiausių veiksnių, turinčių įtakos PGR rezultatams ir gali duoti klaidingai teigiamus rezultatus.
Ne mažiau svarbūs yra įvairūs šaltiniai, dėl kurių gaunami klaidingai neigiami rezultatai. Jei viena ar kelios esminės PGR mišinio dalys arba pati amplifikacijos reakcija yra slopinama arba trukdoma, diagnostinis tyrimas gali būti trukdomas. Tai gali sumažinti efektyvumą ir netgi klaidingai neigiamus rezultatus.
Be slopinimo, tikslinės nukleorūgščių vientisumo praradimas gali atsirasti dėl transportavimo ir (arba) laikymo sąlygų prieš ruošiant mėginį. Visų pirma, aukšta temperatūra arba netinkamas saugojimas gali pakenkti ląstelėms ir nukleino rūgštims. Ląstelių ir audinių fiksacija bei parafino įterpimas yra gerai žinomos DNR fragmentacijos priežastys ir nuolatinė problema (žr. 1 ir 2 pav.). Tokiais atvejais net optimali izoliacija ir valymas nepadės.

1 pav | Imobilizacijos poveikis DNR vientisumui
Agarozės gelio elektroforezė parodė, kad DNR, išskirtos iš skrodimų parafino sekcijų, kokybė labai skyrėsi. Priklausomai nuo fiksavimo metodo, ekstraktuose buvo skirtingo vidutinio fragmento ilgio DNR. DNR buvo išsaugota tik tada, kai buvo fiksuota natūraliuose užšaldytuose mėginiuose ir buferiniame neutraliame formaline. Naudojant stipriai rūgštinį Bouin fiksatorių arba nebuferinį, skruzdžių rūgšties turintį formaliną, buvo smarkiai prarasta DNR. Likusi dalis yra labai suskaidyta.
Kairėje pusėje fragmentų ilgis išreiškiamas kilobazių poromis (kbp)

2 pav | Nukleino rūgščių taikinių vientisumo praradimas
a) 3′-5′ tarpas abiejose grandinėse sukels tikslinės DNR pertrauką. DNR sintezė vis tiek vyks mažame fragmente. Tačiau jei DNR fragmente trūksta pradmenų susijungimo vietos, vyksta tik linijinė amplifikacija. Palankiausiu atveju fragmentai gali vėl prisotinti vienas kitą, tačiau išeiga bus nedidelė ir mažesnė už aptikimo lygį.
b) Bazių praradimas, daugiausia dėl depurinacijos ir timidino dimero susidarymo, sumažina H jungčių skaičių ir Tm. Pailgėjusios atšilimo fazės metu pradmenys išsilydys nuo matricos DNR ir nesusijungs net esant ne tokioms griežtoms sąlygoms.
c ) Gretimos timino bazės sudaro TT dimerą.
Kita dažna problema, dažnai pasitaikanti molekulinėje diagnostikoje, yra mažesnis nei optimalus tikslinių nukleorūgščių išsiskyrimas, palyginti su fenolio-chloroformo ekstrahavimu. Ypatingais atvejais tai gali būti siejama su klaidingais neigiamais rezultatais. Daug laiko galima sutaupyti virinant lizę arba fermentinį ląstelių liekanų virškinimą, tačiau šis metodas dažnai sukelia mažą PGR jautrumą dėl nepakankamo nukleorūgščių išsiskyrimo.

Polimerazės aktyvumo slopinimas amplifikacijos metu

Apskritai slopinimas naudojamas kaip konteinerio sąvoka, apibūdinanti visus veiksnius, dėl kurių gaunami neoptimalūs PGR rezultatai. Griežtai biochemine prasme slopinimas apsiriboja fermento aktyvumu, ty sumažina arba užkerta kelią substrato-produkto konversijai sąveikaujant su aktyvia DNR polimerazės vieta arba jos kofaktoriumi (pvz., Mg2+ Taq DNR polimerazei).
Mėginio komponentai arba įvairūs buferiai ir ekstraktai, kurių sudėtyje yra reagentų, gali tiesiogiai slopinti fermentą arba sulaikyti jo kofaktorius (pvz., EDTA), taip inaktyvuodami polimerazę ir savo ruožtu sumažėjusius arba klaidingai neigiamus PGR rezultatus.
Tačiau daugelis sąveikų tarp reakcijos komponentų ir taikinių turinčių nukleorūgščių taip pat vadinamos „PGR inhibitoriais“. Kai ląstelės vientisumas suardomas izoliuojant ir išsiskiria nukleino rūgštis, gali atsirasti sąveika tarp mėginio ir jį supančio tirpalo bei kietosios fazės. Pavyzdžiui, „valytojai“ gali surišti viengrandę arba dvigrandę DNR per nekovalentinę sąveiką ir trukdyti izoliacijai bei gryninimui, sumažindami taikinių, kurie galiausiai pasiekia PGR reakcijos indą, skaičių.
Apskritai PGR inhibitorių yra daugumoje kūno skysčių ir reagentų, naudojamų klinikiniams diagnostiniams tyrimams (karbamidas šlapime, hemoglobinas ir heparinas kraujyje), maisto papildai (organiniai komponentai, glikogenas, riebalai, Ca2+ jonai) ir aplinkos komponentai (fenoliai). , sunkieji metalai)

Labiau paplitusių PGR inhibitorių galima rasti bakterijose ir eukariotinėse ląstelėse, netikslinėje DNR, DNR surišančiose audinių matricų makromolekulėse ir laboratorinėje įrangoje, pavyzdžiui, pirštinėse ir plastikuose. Nukleino rūgščių gryninimas ekstrahavimo metu arba po jo yra tinkamiausias PGR inhibitorių pašalinimo būdas.
Šiandien įvairi automatizuota ekstrahavimo įranga gali pakeisti daugybę rankinių protokolų, tačiau 100% atkūrimo ir (arba) taikinių išgryninimo niekada nepavyko pasiekti. Išgrynintose nukleino rūgštyse vis dar gali būti galimų inhibitorių arba jie jau pradėjo veikti. Yra įvairių strategijų, kaip sumažinti inhibitorių poveikį. Tinkamos polimerazės pasirinkimas gali turėti didelės įtakos inhibitorių aktyvumui. Kiti patvirtinti metodai PGR slopinimui sumažinti yra polimerazės koncentracijos didinimas arba priedų, tokių kaip BSA, naudojimas.
PGR reakcijų slopinimą galima įrodyti naudojant vidinę proceso kokybės kontrolę (IPC).
Reikia pasirūpinti, kad visi reagentai ir kiti ekstrakcijos rinkinio tirpalai, pvz., etanolis, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolis ir fenolis, būtų pašalinti iš nukleorūgščių izoliato kruopščiai nuplaunant. Priklausomai nuo jų koncentracijos, jie gali aktyvuoti arba slopinti PGR.