Interferencijos faktoriai PGR reakcijose

PGR reakcijos metu dažnai susiduria kai kurie trukdantys veiksniai.
Dėl labai didelio PGR jautrumo užterštumas laikomas vienu iš svarbiausių veiksnių, turinčių įtakos PGR rezultatams, ir gali duoti klaidingų teigiamų rezultatų.
Lygiai taip pat kritiški yra įvairūs šaltiniai, kurie lemia klaidingai neigiamus rezultatus. Jei viena ar kelios svarbios PGR mišinio dalys ar pati amplifikacijos reakcija yra slopinama ar trukdoma, diagnostinis tyrimas gali trukdyti. Tai gali sumažinti efektyvumą ir net klaidingus neigiamus rezultatus.
Be slopinimo, prieš paruošiant mėginį, tikslinės nukleorūgščių vientisumas gali prarasti ir dėl gabenimo ir (arba) laikymo sąlygų. Visų pirma, aukšta temperatūra ar netinkama laikymas gali pakenkti ląstelėms ir nukleorūgštėms. Ląstelių ir audinių fiksacija ir parafino įterpimas yra gerai žinomos DNR suskaidymo priežastys ir nuolatinė problema (žr. 1 ir 2 paveikslus). Tokiais atvejais net optimalus izoliacija ir apsivalymas nepadės.

1 pav. | Imobilizacijos poveikis DNR vientisumui
Agarozės gelio elektroforezė parodė, kad DNR, išskirtos iš parafino skrodimų skyrių, kokybė labai skyrėsi. Skirtingo vidutinio fragmento ilgio DNR buvo ekstraktuose, atsižvelgiant į fiksavimo metodą. DNR buvo išsaugota tik tada, kai fiksuota vietiniuose užšaldytuose mėginiuose ir buferiniame neutraliame formaline. Naudojant stipriai rūgščių bouin fiksuotų ar nepakenčiamų, skruzdžių rūgšties turinčio formalino, smarkiai prarado DNR. Likusi frakcija yra labai suskaidyta.
Kairėje fragmentų ilgis išreiškiamas kilobase porose (KBP)

2 pav. | Nukleorūgšties taikinių vientisumo praradimas
(a) A abiejų sruogų 3′-5 ′ tarpas sukels tikslinės DNR pertrauką. DNR sintezė vis dar įvyks ant mažo fragmento. Tačiau jei DNR fragmente trūksta grunto atkaitinimo vietos, įvyksta tik tiesinė amplifikacija. Palankiausiu atveju fragmentai gali atstatyti vienas kitą, tačiau derlius bus mažas ir žemesnis aptikimo lygis.
(B) Bazių praradimas, daugiausia dėl depurinacijos ir timidino dimerio susidarymo, lemia H jungčių skaičiaus sumažėjimą ir sumažėja TM. Pailgos atšilimo fazės metu pradmenys ištirps nuo matricos DNR ir nebus atominė net ne tokiomis griežtomis sąlygomis.
c) Gretimos timino bazės sudaro TT dimerą.
Kita dažna problema, kuri dažnai atsiranda atliekant molekulinę diagnostiką, yra mažiau nei optimalus tikslinių nukleorūgščių išsiskyrimas, palyginti su fenolio-chloroformo ekstrahavimu. Kraštutiniais atvejais tai gali būti siejama su melagingais negatyvais. Daug laiko galima sutaupyti virimo lize arba fermentiniu ląstelių šiukšlių virškinimu, tačiau šis metodas dažnai lemia mažą PGR jautrumą dėl nepakankamo nukleorūgšties išsiskyrimo.

Polimerazės aktyvumo slopinimas amplifikacijos metu

Apskritai slopinimas naudojamas kaip konteinerio koncepcija apibūdinti visus veiksnius, lemiančius neoptimalius PGR rezultatus. Griežtai biochemine prasme slopinimas apsiriboja fermento aktyvumu, ty jis sumažina arba apsaugo nuo substrato produkto virsmo per sąveiką su aktyvia DNR polimerazės ar jos kofaktoriaus vieta (pvz., Mg2+ Taq DNR polimerazei).
Mėginyje ar įvairiuose buferiuose ir ekstraktuose, kuriuose yra reagentų, komponentai gali tiesiogiai slopinti fermentą arba sulaikyti jo kofaktorius (pvz.
Tačiau daugelis reakcijos komponentų ir tikslinių nukleorūgščių sąveikos taip pat yra vadinamos „PGR inhibitoriais“. Kai ląstelės vientisumas sutrikdo izoliacija ir išsiskiria nukleino rūgštis, gali atsirasti mėginio ir aplinkinio tirpalo sąveika bei kietos fazės sąveika. Pvz., „Scavengers“ gali surišti vienos ar dvigubos grandinės DNR per nekovalentinę sąveiką ir trukdyti izoliacijai ir valymui, sumažinant taikinių, kurie galiausiai pasiekia PGR reakcijos indą, skaičių.
Apskritai, PGR inhibitoriai yra daugelyje kūno skysčių ir reagentų, naudojamų klinikiniams diagnostiniams tyrimams (karbamido šlapime, hemoglobino ir heparino kraujyje), maisto papildų (organinių komponentų, glikogeno, riebalų, CA2+ jonų) ir komponentų aplinkoje (fenoliai, sunkieji metalai).

Daugiau paplitusių PGR inhibitorių galima rasti bakterijose ir eukariotinėse ląstelėse, netikslinėje DNR, DNR surišančiose audinių matricų ir laboratorinių įrenginių, tokių kaip pirštinės ir plastikai, makromolekules. Nukleorūgščių valymas ekstrahuojant ar po jo yra tinkamiausias metodas PGR inhibitoriams pašalinti.
Šiandien įvairia automatizuota ištraukimo įranga gali pakeisti daugybę rankinių protokolų, tačiau 100% atkūrimas ir (arba) tikslų valymas niekada nebuvo pasiektas. Potencialūs inhibitoriai vis dar gali būti išgrynintose nukleorūgštėse arba jau gali būti įsigaliojusios. Yra skirtingų strategijų, kaip sumažinti inhibitorių poveikį. Tinkamos polimerazės pasirinkimas gali turėti didelę įtaką inhibitorių aktyvumui. Kiti įrodyti PGR slopinimo metodai padidina polimerazės koncentraciją arba tokių priedų kaip BSA taikymas.
PGR reakcijų slopinimą galima parodyti naudojant vidinio proceso kokybės kontrolę (IPC).
Reikia atsargiai pašalinti visus ekstrahavimo rinkinyje esančius reagentus ir kitus sprendimus, tokius kaip etanolis, EDTA, Cetab, Licl, Guscn, SDS, Izopropanolis ir fenolio, iš nukleorūgšties izoliato atliekant kruopščią skalbimo žingsnį. Priklausomai nuo jų koncentracijos, jie gali suaktyvinti arba slopinti PGR.