Interferenciniai veiksniai PGR reakcijose

PGR reakcijos metu dažnai susiduriama su tam tikrais trukdančiais veiksniais.
Dėl labai didelio PGR jautrumo, užterštumas laikomas vienu iš svarbiausių veiksnių, turinčių įtakos PGR rezultatams ir galinčių duoti klaidingai teigiamus rezultatus.
Lygiai taip pat svarbūs įvairūs šaltiniai, lemiantys klaidingai neigiamus rezultatus. Jei viena ar kelios esminės PGR mišinio dalys arba pati amplifikacijos reakcija yra slopinamos arba sutrikdomos, diagnostinis tyrimas gali būti sutrikdytas. Dėl to gali sumažėti efektyvumas ir netgi būti gauti klaidingai neigiami rezultatai.
Be slopinimo, tikslinės nukleorūgščių vientisumas gali būti prarastas dėl transportavimo ir (arba) laikymo sąlygų prieš mėginio paruošimą. Ypač aukšta temperatūra arba netinkamas laikymas gali pažeisti ląsteles ir nukleorūgštis. Ląstelių ir audinių fiksacija bei įterpimas į parafiną yra gerai žinomos DNR fragmentacijos priežastys ir nuolatinė problema (žr. 1 ir 2 pav.). Tokiais atvejais net optimalus išskyrimas ir gryninimas nepadės.

1 pav. | Imobilizacijos poveikis DNR vientisumui
Agarozės gelio elektroforezė parodė, kad iš autopsijų parafino pjūvių išskirtos DNR kokybė labai skyrėsi. Ekstraktuose buvo aptikta skirtingo vidutinio fragmentų ilgio DNR, priklausomai nuo fiksavimo metodo. DNR išsilaikė tik fiksuota natūraliuose užšaldytuose mėginiuose ir buferiniame neutraliame formaline. Naudojant stipriai rūgštų Bouin fiksatorių arba nebuferinį, skruzdžių rūgšties turintį formaliną, DNR sumažėjo reikšmingai. Likusi frakcija yra labai fragmentuota.
Kairėje pusėje fragmentų ilgis išreiškiamas kilobazių poromis (kbp).

2 pav. | Nukleino rūgščių taikinių vientisumo praradimas
(a) 3′-5′ tarpas abiejose grandinėse sukels tikslinės DNR nutrūkimą. DNR sintezė mažame fragmente vis tiek vyks. Tačiau jei DNR fragmente trūksta pradmens prijungimo vietos, vyksta tik tiesinė amplifikacija. Palankiausiu atveju fragmentai gali vienas kitą pakartotinai prisotinti, tačiau išeiga bus maža ir mažesnė už aptikimo lygį.
(b) Bazių netekimas, daugiausia dėl depurinacijos ir timidino dimerų susidarymo, sumažina vandenilinių jungčių skaičių ir Tm. Pailgėjusios atšilimo fazės metu pradmenys išsilydys nuo matricos DNR ir neprisijungs net ir mažiau griežtomis sąlygomis.
(c) Gretimos timino bazės sudaro TT dimerą.
Kita dažna molekulinės diagnostikos problema yra neoptimalus tikslinių nukleorūgščių išsiskyrimas, palyginti su fenolio-chloroformo ekstrakcija. Kraštutiniais atvejais tai gali būti susiję su klaidingai neigiamais rezultatais. Daug laiko galima sutaupyti virinant lizę arba fermentiniu ląstelių nuosėdų virškinimu, tačiau šis metodas dažnai lemia mažą PGR jautrumą dėl nepakankamo nukleorūgščių išsiskyrimo.

Polimerazės aktyvumo slopinimas amplifikacijos metu

Paprastai slopinimas vartojamas kaip bendra sąvoka, apibūdinanti visus veiksnius, lemiančius neoptimalius PGR rezultatus. Griežtai biocheminiu požiūriu slopinimas apsiriboja fermento aktyvumu, t. y. jis sumažina arba užkerta kelią substrato virtimui produktu per sąveiką su DNR polimerazės arba jos kofaktoriaus aktyviąja vieta (pvz., Mg2+, jei tai Taq DNR polimerazė).
Mėginio komponentai arba įvairūs buferiai ir ekstraktai, kuriuose yra reagentų, gali tiesiogiai slopinti fermentą arba sulaikyti jo kofaktorius (pvz., EDTA), tokiu būdu inaktyvuodami polimerazę ir savo ruožtu sumažindami arba klaidingai neigiamus PGR rezultatus.
Tačiau daugelis reakcijos komponentų ir taikinius turinčių nukleorūgščių sąveikų taip pat vadinamos „PGR inhibitoriais“. Kai ląstelės vientisumas sutrikdomas izoliacijos būdu ir nukleorūgštis išsiskiria, gali prasidėti sąveika tarp mėginio ir jį supančio tirpalo bei kietosios fazės. Pavyzdžiui, „gaudyklės“ gali jungtis prie viengrandės arba dvigrandės DNR per nekovalentinę sąveiką ir trukdyti izoliacijai bei gryninimui, sumažindamos taikinių, kurie galiausiai pasiekia PGR reakcijos indą, skaičių.
Apskritai PGR inhibitorių yra daugumoje kūno skysčių ir reagentų, naudojamų klinikiniams diagnostiniams tyrimams (šlapalas šlapime, hemoglobinas ir heparinas kraujyje), maisto papilduose (organiniai komponentai, glikogenas, riebalai, Ca2+ jonai) ir aplinkos komponentuose (fenoliai, sunkieji metalai).

Dažniau PGR inhibitorių galima rasti bakterijose ir eukariotinėse ląstelėse, netikslinėje DNR, DNR surišančiose audinių matricų makromolekulėse ir laboratorinėje įrangoje, pavyzdžiui, pirštinėse ir plastikuose. Nukleino rūgščių valymas ekstrakcijos metu arba po jos yra pageidaujamas PGR inhibitorių pašalinimo metodas.
Šiandien įvairi automatizuota ekstrahavimo įranga gali pakeisti daugelį rankinių protokolų, tačiau 100 % taikinių atgavimas ir (arba) išgryninimas niekada nebuvo pasiektas. Išgrynintose nukleorūgštyse vis dar gali būti potencialių inhibitorių arba jie jau gali būti pradėję veikti. Yra įvairių strategijų, kaip sumažinti inhibitorių poveikį. Tinkamos polimerazės pasirinkimas gali turėti didelės įtakos inhibitoriaus aktyvumui. Kiti patikrinti PGR slopinimo mažinimo metodai yra polimerazės koncentracijos didinimas arba priedų, tokių kaip BSA, naudojimas.
PGR reakcijų slopinimą galima įrodyti naudojant vidinę proceso kokybės kontrolę (IPC).
Iš nukleorūgščių izoliato kruopščiai nuplaunant reikia atsargiai pašalinti visus ekstrakcijos rinkinyje esančius reagentus ir kitus tirpalus, pvz., etanolį, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanolį ir fenolį. Priklausomai nuo jų koncentracijos, jie gali aktyvuoti arba slopinti PGR.